NGHIÊN CỨU ĐỐI ĐẦU SO SÁNH BỐN HỆ THỐNG PHÂN TÁCH TẾ BÀO GỐC THƯƠNG MẠI

NGHIÊN CỨU ĐỐI ĐẦU SO SÁNH BỐN HỆ THỐNG PHÂN TÁCH TẾ BÀO GỐC THƯƠNG MẠI
Tác giả: Joel A. Aronowitz, M.D.
Joshua D. I. Ellenhorn, M.D.
Los Angeles, Calif.
From the University of Southern California Keck School of Medicine; the John Wayne Cancer Center; and Cedars-Sinai Medical Center.
Received for publication March 16, 2013; accepted June 4, 2013.
Copyright © 2013 by the American Society of Plastic Surgeons
Nguồn tham khảo: Volume 132, Number 6 • Isolation of Stromal Vascular Fraction
DOI: 10.1097/PRS.0b013e3182a80652

Ghép mỡ tự thân là một liệu pháp được chấp nhận trên nhiều chỉ định lâm sàng khác nhau, bao gồm nâng mô mềm, cải thiện những khu vực mô bị chiếu xạ và chấn thương cùng nhiều ứng dụng thẩm mỹ. Sự cải thiện về kết quả và mức độ bền vững của mô ghép bằng cách kết hợp mỡ ghép với những tế bào đầu dòng mạch máu tự thân được tìm thấy trong thành phần tạo mạch nền của mô mỡ là một kỹ thuật mới và là đề tài của rất nhiều nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng. Ngày càng có nhiều dữ liệu nghiên cứu về độ an toàn và hiệu quả của việc tiếp cận kỹ thuật ghép mỡ ở mức độ tế bào và dẫn đến nhu cầu về một hệ thống cho phép phân tách phân đoạn tế bào tạo mạch nền từ mỡ hút để sử dụng trong phòng phẫu thuật. Điều này dẫn đến sự ra đời của nhiều hệ thống phân lập phân đoạn tạo mạch nền tự động, bán tự động và thủ công hiện có mặt trên thị trường để tạo ra phân đoạn tạo mạch nền có thể sử dụng ngay tại chỗ. Thật khó khăn cho nhà lâm sàng trong việc đánh giá hiệu quả của những phương pháp phân tách hiện có vì hiện có quá ít dữ liệu so sánh hiệu quả giữa chúng. Ngoài ra, không thể sử dụng những dữ liệu được báo cáo trong y văn về hiệu quả của những phương pháp này vì có sự khác biệt về phương pháp đo lường và tiêu chí đánh giá. Những thông số quan trọng trên lâm sàng để so sánh bao gồm thời gian vận hành, dung tích, số lượng tế bào, khả năng sống, tính đồng nhất marker bề mặt, dữ liệu về độ an toàn của tế bào, chi phí ban đầu và chi phí vận hành. Báo cáo này sẽ trình bày một nghiên cứu tiến cứu, làm mù, so sánh hiệu quả của bốn hệ thống phân tách phân đoạn tế bào tạo mạch nền mô mỡ hiện có trên thị trường được thực hiện trong điều kiện lâm sàng phẫu thuật ngoại trú có kiểm soát và sử dụng những mẫu mỡ hút tươi tương đồng.

BỆNH NHÂN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Lấy mô
Nghiên cứu được cho phép thực hiện bởi Hội Đồng Phê Duyệt Trung Tâm Y Khoa Cedars-Sinai, ngoài ra tất cả những người cho mỡ đều phải cam kết chấp thuận trước khi tiến hành nghiên cứu. Mô mỡ được thu nhận bằng phương pháp hút mỡ tumescent dựa trên một quy trình đã tiêu chuẩn hóa về thể tích dung dịch tumescent trên một khu vực, cannula lấy mỡ và áp suất chân không. Mỡ được lấy từ vùng bụng của năm người phụ nữ khỏe mạnh sử dụng áp lực âm 25 đến 28 mmHg. Sau khi lấy mỡ, máu và dịch mỡ thừa được loại bỏ bằng phương pháp lắng gạn; thể tích mỡ sẵn sàng cho phân tách tế bào là khoảng 600-800 cc/người. Mỡ không trải qua thêm bất kỳ quy trình lọc rửa nào trước khi tiến hành phân tách trên bốn hệ thống.
Tiến trình hút mỡ
Mỡ từ mỗi người được trộn nhẹ nhàng đến đồng nhất và sau đó chia đều thành 4 phân đoạn. Bốn hệ thống trên thị trường được sử dụng trong nghiên cứu so sánh này bao gồm Multi Station (hệ thống mở, vận hành thủ công bao gồm bình lắc/bếp đun và thiết bị ly tâm dung tích lớn được tích hợp và vận hành trong tủ an toàn sinh học với lọc HEPA và tia cực tím của PNC International, Gyeonggido, Hàn Quốc) (Hình 1, phía trên bên trái); Cha-Station (hệ thống kín, vận hành bán tự động của CHA Biotech, Kangnamgu, Hàn Quốc) (Hình 1, phía trên bên phải); Celution 800/CRS (hệ thống kín tự động hoàn toàn của Cytori Therapeutics, Inc., San Diego, Calif.) (Hình 1, phía dưới bên trái) và Lipokit với MaxStem (hệ thống kín vận hành thủ công của Medi-Khan West Hollywood, Calif.) (Hình 1, phía dưới bên phải). Tất cả các hệ thống đều được đặt tại phòng phẫu thuật và vận hành theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất. Quá trình thu phân đoạn tạo mạch nền từ mô được tiến hành đồng thời trên cả bốn hệ thống. Thể tích mô tiến hành trên mỗi hệ thống nằm ở khoảng giữa của giới hạn thể tích vận hành được khuyến cáo bởi nhà sản xuất. Tổng thời gian vận hành được ghi nhận. Mẫu thu thập sau khi phân tách trên mỗi thiết bị được đánh số ngẫu nhiên để kỹ thuật viên tiến hành định lượng không biết được là mẫu đó do thiết bị nào phân tách.
Phân tích phân đoạn tạo mạch nền.
Tổng số tế bào có nhân sống và tỉ lệ sống được xác định bằng máy đếm nhân tế bào (NucleoCounter của ChemoMetec, Allerod, Đan Mạch). Số lượng tế bào sống được chuẩn hóa bằng cách tính toán dựa trên khối lượng mô. Tế bào trong phân đoạn tạo mạch nền được xác định bằng phương pháp đếm tế bào theo kiểu dòng chảy dựa trên sự biểu hiện những marker bề mặt CD31, CD34 và CD45. Tần số tế bào gốc mô mỡ được ước lượng bằng phương pháp định lượng clonogenic đơn vị cụm tạo nguyên bào sợi. Hoạt tính collagenase tồn dư trong phân đoạn tạo mạch nền từ mỗi hệ thống được định lượng bằng phương pháp phân tách ligand huỳnh quang với bộ kit đã thương mại hóa (Kit định lượng EnzChek Gelatinase; Life Technologies, Carlsbad, Calif)
Định lượng clonogenic đơn vị cụm tạo nguyên bào sợi
Tế bào thu được từ những thiết bị khác nhau được pha loãng thành 2 nồng độ (1000 tế bào/giếng và 5000 tế bào/giếng trên đĩa 6 giếng) trong môi trường tăng trưởng tế bào đệm mô mỡ tiêu chuẩn (Dulbecco’s Modified Eagle Medium: F12 với 10% huyết thanh bào thai bò và 1% penicillin/streptomycin kháng nấm). Những khóm tế bào tăng trưởng trong khoảng từ 10-14 ngày, phụ thuộc vào tốc độ phát triển của tế bào. Trên đĩa cấy nơi những khóm tế bào nhanh chón áp sát lẫn nhau, quá trình định lượng được cho ngưng lại để tế bào không phát triển quá mức dẫn đến không thể đếm được số khóm. Khi kết thúc quá trình định lượng, đĩa nuôi cấy được rửa bằng dung dịch muối đệm phosphate một lần và trộn với dung dịch đệm formalin trung tính trong 15 phút. Số khóm tế bào được đếm bằng cách sử dụng kính hiển vi pha tương phản. Cả 6 giếng trên đĩa đều được cho đếm tế bào, tuy nhiên những giếng có số khóm cao nhất và thấp nhất đều bị loại bỏ, giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của bốn giếng còn lại được sử dụng để tính tỉ lệ phần trăm cuối cùng.
Phân tích thống kê
Số tế bào có nhân trung bình và tỉ lệ sống, số đơn vị cụm tạo nguyên bào sợi (tỉ lệ phần trăm), hoạt tính protease tồn dư và thành phần dân số tế bào được so sánh dựa trên mô hình tuyến tính tác động hỗn hợp với hệ thống vận hành được xem là tác động cố định và bệnh nhân là tác động ngẫu nhiên. Cấu trúc hiệp phương sai với phương sai không cân bằng giữa những hệ thống vận hành được sử dụng nếu phương sai không đồng nhất. Biểu đồ histogram của phần dư và điểm phân vị được sử dụng để đánh giá sự vi phạm giả định bình thường. Phương pháp kiểm định ý nghĩa Tukey được sử dụng để so sánh sự khác nhau giữa những hệ thống vận hành. Phương pháp so sánh giá trị trung bình Tukey cũng được sử dụng để đánh giá sự khác biệt. Ý nghĩa thống kê được xác định khi p<0.05. Thanh sai số trên biểu đồ biểu hiện độ lệch chuẩn.


KẾT QUẢ
Nhận diện phân đoạn tạo mạch nền
Số tế bào có nhân sống trung bình thu nhận từ mỗi gam mô khi tiến hành trên mỗi hệ thống được biểu diễn trong biểu đồ 2. Trung bình, hệ thống Celution thu được lượng tế bào có nhân sống cao hơn gấp 2 lần so với hệ thống Multi Station, gấp 7 và 36 lần so với Lipokit và Cha-Station (p<0.05 cho mọi phép so sánh). Tỉ lệ tế bào có nhân sống cao nhất với hệ thống Celution (93 ± 2 %, trung bình ± độ lệch chuẩn), sau đó là Cha-Station (87 ± 12 %), Lipokit (72 ± 15 %) và thấp nhất là mẫu thu được từ Multi Station (57 ± 21 %). 

So sánh về thành phần các loại tế bào trên tổng dân số được tạo ra bởi những thiết bị khác nhau cũng cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Phân đoạn tạo mạch nền thu được từ Lipokit, Multi Station và Cha-Station là tương tự nhau về tỉ lệ tương đối của các thành phần trong dân số tế bào. Tuy nhiên, số lượng tế bào sống thu được từ Cha-Station là quá ít và kết quả từ máy đếm tế bào dòng chảy chỉ có thể cho kết quả ở 3 trong 5 lần thực nghiệm. Ngược lại, hệ thống Celution thu được dân số tế bào có tỉ lệ tế bào biểu mô (CD34+/CD31+) cao hơn so với ba hệ thống khác (p=0.003) (Hình 3, phía trên bên trái); tỉ lệ CD34+/CD31-/CD45- (bao gồm các tế bào đầu dòng, tế bào đệm và tế bào mạch máu khác) (Hình 3, phía trên bên phải) cũng cao hơn khi sử dụng Celution (p=0.056). Celution thu được thành phần tế bào đầu dòng cao hơn có ý nghĩa thống kê khi sử dụng phương pháp định lượng đơn vị cụm tạo nguyên bào sợi (Hình 3 bên dưới) (p=0.002, Celution so với ba hệ thống còn lại).

Celution thu được kết quả cao hơn về tỉ lệ tế bào biểu mô, tế bào CD34+/CD31-/CD45-, số đơn vị cụm tạo nguyên bào sợi và cả tổng lượng tế bào có nhân, nhờ đó hệ thống Celution biểu thị một số lượng cao hơn có ý nghĩa thống kê khi so sánh cả ba kiểu tế bào chính (Hinh 4) (p < 0.05 cho Celution so với ba hệ thống khác). Mẫu thu được từ hệ thống Celution trung bình có số đơn vị cụm tạo nguyên bào sợi trên mỗi gam mô cao hơn gấp 6.6 lần so với Multi Station, 63.6 lần so với Lipokit và 99.3 lần so với Cha-Station (Hình 4, bên dưới).

Hoạt tính collagenase tồn dư
Tất cả bốn hệ thống đều sử dụng dung dịch enzyme ly giải protein có thành phần chính là collagenase loại I và loại II. Nồng độ enzyme còn lại trong hỗn dịch tế bào vào cuối quá trình phân tách là một thông số nói lên độ an toàn của phương pháp trị liệu tế bào. Hoạt tính collagenase tồn dư trong mẫu tế bào thu được từ những hệ thống này được biểu diễn trong hình 5. Phân đoạn tạo mạch nền được tạo thành từ hệ thống Celution, Cha-Station và Multi Station chứa ít hoạt tính collagenase hơn có ý nghĩa thống kê so với phân đoạn tạo mạch nền từ hệ thống Lipokit (p < 0.0001). Ngoài ra, Celution vẫn cho hoạt tính enzyme thấp hơn hai hệ thống khác, mặc dù sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê vì có sự biến thiên quá lớn về hoạt tính enzyme tồn dư trong phân đoạn tạo mạch nền của Multi Station và Cha-Station. Khi dữ liệu được chuẩn hóa trong mỗi lần thực hiện để loại trừ ảnh hưởng do người cho mỡ  gây ra, mẫu thu được từ Multi Station chứa hoạt tính enzyme trung bình cao hơn gấp 5.1 lần so với hệ thống Celution; Cha-Station cao hơn gấp 13 lần; và Lipokit cao hơn gấp 57 lần.


BÀN LUẬN
Việc hình thành tiêu chuẩn cho các thiết bị phân lập phân đoạn tế bào tạo mạch nền sử dụng trên lâm sàng là vấn đề thiết yếu cho việc áp dụng công nghệ này trong điều trị cấy ghép. Các thông số chính cần đánh giá bao gồm thể tích mỡ hút, hoạt tính enzyme tồn dư, lượng tế bào có nhân thu được, tỉ lệ sống và thành phần. Chi phí và tổng thời gian vận hành cũng là những vấn đề quan trọng cần xem xét trong thực hành lâm sàng. Một nghiên cứu tương tự trước đó đã so sánh ba hệ thống phân tách tế bào nhưng không nhận diện và phân loại tế bào, cũng không ghi nhận số lượng đơn vị cụm tế bào tạo thành. (Aronowitz và Watson, 2012).
Nghiên cứu tiến cứu, làm mù của chúng tôi đánh giá những vấn đề này trên bốn hệ thống phân tách tế bào đang có trên thị trường, tiến hành trong phòng phẫu thuật với tiến trình thời gian xác định. Mỗi hệ thống đều thu được những lượng tế bào có nhân sống từ tế bào tự thân với tiến trình sử dụng trong thực tế lâm sàng (<120 phút). Tuy nhiên, những hệ thống này có thiết kế kỹ thuật và mức độ tự động hóa khác nhau. Multi Station về cơ bản là một phòng thí nghiệm sinh học thu nhỏ, đòi hỏi một kỹ thuật viên thực hiện tất cả các bước một cách thủ công. Ngược lại, Celution là một hệ thống tự động hoàn toàn và chỉ có công đoạn lắp ráp các vật tư tiêu hao vào là thủ công. Những hệ thống này cũng có sự khác nhau về thời điểm phân ly mỡ bằng collagenase, quá trình trung tính hóa, về thời gian cũng như cường độ ly tâm.
Để kỹ thuật viên đánh giá sự khác biệt về hiệu quả ly tách phân đoạn tế bào taọ mạch nền, cần đánh giá được số lượng và chất lượng tế bào thu được từ những hệ thống khác nhau. Mặc dù được thực hiện theo những quy trình tương tự, điều kiện vận hành và lượng mỡ gần như giống nhau, những hệ thống cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Ví dụ, lượng tế bào có nhân thu được từ hệ thống Celution và Multi Station là cao nhất, mặc dù Multi Station cho thấy sự thiếu ổn định về số lượng tế bào và tỉ lệ tế bào sống là thấp nhất trong bốn hệ thống. Mức độ biến thiên về số lượng tế bào dường như có liên quan đến kỹ thuật vận hành vì Multi Station là một hệ thống thủ công hoàn toàn. Cha-Station và Lipokit với MaxStem thu được lượng tế bào thấp hơn đáng kể, mặc dù tỉ lệ sống tương đối là cao hơn so với Multi Station.
Cũng thật hợp lý khi cho rằng thành phần loại tế bào có trong dân số tổng sẽ ảnh hưởng đến kết quả; ví dụ, nếu phân đoạn tế bào thu được chứa quá nhiều tế bào bạch cầu, tỉ lệ phân đoạn tạo mạch nền trong tổng lượng tế bào có nhân sẽ ít hơn đáng kể. Phương pháp đếm tế bào dòng chảy và phân tích định lượng miễn dịch những phân nhóm của phân đoạn tạo mạch nền được thực hiện trên tất cả các mẫu. Một điều không may là số lượng tế bào có nhân thu được từ Cha-Station quá ít để thực hiện phương pháp đếm tế bào kiểu dòng chảy ở ba trong năm lần thực nghiệm. Kết quả phân tích cho thấy thành phần tế bào của Lipokit, Multi Station và MaxStem chứa nồng độ tế bào biểu mô, CD34+/CD31- và tế bào gốc (số đơn vị cụm tạo thành nguyên bào sợi) thấp hơn đáng kể so với hệ thống Celution (Hình 3). Khi xem xét việc đưa những hệ thống này vào thực hành lâm sàng, yếu tố chính không phải là tần số tương đối mà là tổng số tế bào tuyệt đối. Số tế bào của 3 phân nhóm chính trong phân đoạn tạo mạch nền (bao gồm tế bào gốc) thu được từ Celution cao hơn một cách đáng kể so với những hệ thống khác (Hình 4). Số đơn vị cụm tạo nguyên bào sợi trung bình thu được với hệ thống Celution cao hơn so với Multi Station 20.7 lần, so với Cha-Station 145 lần và Lipokit với MaxStem là 36 lần. Cũng cần nói thêm rằng mặc dù đơn vị cụm tạo nguyên bào sợi tương quan với số lượng tế bào gốc, đây không phải là phương pháp tiêu chuẩn để nhận diện tế bào gốc. Những phương pháp định lượng khác (vượt quá phạm vi của nghiên cứu này) có thể cho phép nhận diện rõ hơn mật độ tế bào gốc trong các sản phẩm tế bào.
Giữa các hệ thống cũng có sự khác biệt về hoạt tính protease tồn dư, hoạt tính enzyme khi sử dụng hệ thống Celution có xu hướng thấp hơn so với ba hệ thống còn lại. Khi dữ liệu được chuẩn hóa trong mỗi lần thực nghiệm để loại bỏ sự ảnh hưởng của người cho mỡ, mẫu thu được từ Multi Station chứa hoạt tính enzyme trung bình cao hơn 5.1 lần so với hệ thống Celution; Cha-Station chứa hoạt tính enzyme cao hơn hệ thống Celution 13 lần và Lipokit cao hơn 57 lần. 
Ý nghĩa lâm sàng của hoạt tính collagense tồn dư vẫn chưa được xác định, tuy nhiên cần nói thêm rằng hiện nay kỹ thuật tiêm collagenase vào trong não đang được sử dụng rộng rãi để gây xuất huyết não trong mô hình thực nghiệm trên chuột. Ngoài ra, Santyl (một thuốc mỡ chứa thành phần chủ yếu là collagenase, Smith & Nephew, London, Anh) cũng đang được sử dụng để cắt lọc chủ động vết thương. 
Ngoài ra, sự biến thiên của những thông số hệ thống cũng cần được cân nhắc. Sự biến thiên của Celution thấp hơn một cách đáng kể so với bất kỳ hệ thống nào khác, điều này thể hiện ở kích thước tương đối của thanh sai số trên biểu đồ và các dữ liệu được đề cập trong nghiên cứu này. Ví dụ, về số tế bào gốc trên mỗi gam mô mỡ, độ lệch chuẩn tương đối của Multi Station là 180%, của Cha-Station là 96%, của Lipokit là 76% và của hệ thống Celution chỉ là 36%.

KẾT LUẬN
Kết luận, nghiên cứu này chứng minh tính khả thi của hệ thống phân lập phân đoạn tạo mạch nền hướng đến nhu cầu sử dụng trong điều trị, dựa trên một số hệ thống đang có mặt trên thị trường. Số tế bào có nhân sống tương quan một cách có ý nghĩa thống kê với số đơn vị cụm tạo thành, điều này cho thấy độ tin cậy của phép thử trong việc so sánh những hệ thống phân lập trong điều kiện lâm sàng. Hệ thống Celution tạo ra phân đoạn tế bào có chất lượng và độ lặp lại cao nhất. Ngoài ra, hệ thống Celution có hoạt tính enzyme tồn dư ở mức thấp nhất, thông số này được xem là tiêu chuẩn an toàn các hệ thống phân tách tế bào gốc sử dụng trong lâm sàng.